HIGH THROUGHPUT SEQUENCING TESTING OF SMALL RNAS EMPOWERS THE SIMULTANEOUS DETECTION OF CITRUS VIRUSES AND VIROIDS

G. Licciardello (1), G. Scuderi (2), M. Russo (2), M.C. Bazzano (2), R. Ferraro (2), C. Oliveri (3), A.F. Catara (2)

(1) Council for Agricultural Research and Economics (CREA) Research Centre for Olive, Citrus and Tree fruit, Acireale, Italy;

(2) Agrobiotech soc. coop. Catania, Italy;

(3) Agronomic consultant of Novarancia project. E-mail: grazia.licciardello@crea.gov.it

Citrus are affected by a relevant number of viruses and viroids routinely tested by bioindexing and molecular assays. Anyway, the selection of virus free mother trees candidate for the foundation block requires a process of shoot tip grafting and biological indexing in greenhouse and molecular assays.
A challenge which needs adequate professional and technical resources. Recent papers have shown the adoption of High Throughput Sequencing (HTS) technology is effective for the simultaneous detection and identification of viruses and viroids in Citrus and other crops, as pre-screening to conventional detection methods to solve ambiguous results. To explore the reliability of a potential HTS-based virus detection protocol in association of bioinformatic strategies, within the project Novarancia we developed a pilot testing of different field trees in parallel with molecular and biological methods. Three sweet orange trees and two alemow seedlings previously indexed by conventional methods were re-analyzed by HTS of small RNAs. High-quality reads, depleted of the Citrus sinensis genome, were aligned with reference genomes of 13 viruses and 6 viroids and analyzed by a bioinformatic pipeline. A genome coverage above 90% was assumed indicative of the presence of a specific genotype, and coverage > 50% of potential presence of variants not represented in the read mapping reference list. The results show the implementation of conventional certification scheme with HTS sequencing of small RNAs speeds up the time over all required and reduces the greenhouse footprint, labor, time, and cost needed for bioindexing.


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Innovazioni tecnologiche per la valorizzazione fitosanitaria dell’Arancia Rossa di Sicilia IGP

In allegato il materiale utilizzato dal prof. Catara durante la sagra dell’Arancia Rossa di Centuripe dello scorso Aprile.

Innovazioni tecnologiche per la certificazione genetica e fitosanitaria

Di seguito l’articolo di Gaetano Piccione pubblicato da FreshPlaza, rivista online destinata alle società operanti nel settore ortofrutticolo.

Procede a passo spedito il progetto NovArancia, un progetto di trasferimento tecnologico finanziato dal PSR Sicilia 2014-2022 (bando 10/08/2018), che mira a introdurre “Innovazioni tecnologiche per la valorizzazione e la tracciabilità dell’Arancia rossa“. Fra esse, il sequenziamento ad elevata processività (High Throughput Sequencing, HTS) del genoma della pianta e di tutti i virus e viroidi eventualmente presenti, e l’analisi bioinformatica dei rispettivi genomi.

Si tratta di una tecnologia impiegata con varie finalità e che il progetto NovArancia intende finalizzare per la certificazione genetica e sanitaria delle piante madri capostipiti di diversi cloni di arancio a polpa rossa.

Hans J. Maree, Rachelle Bester, Grazia Licciardello, Antonino Catara, Salvatore Leocata

“Nel settore fitosanitario – spiega Antonino Catara, Innovation broker del progetto – i risultati più avanzati sull’uso dell’HTS sono stati ottenuti dal professore Hans J Maree e dalla dottoressa Rachelle Bester, che operano presso il Citrus Research International (CRI) e l’Università di Stellenbosch del Sudafrica. Entrambi hanno messo a punto procedure di validazione a vantaggio della robustezza della tecnica, delle quali abbiamo discusso nel corso di incontri avvenuti nei giorni scorsi”.

Presso il Dipartimento Di3A dell’Università di Catania, i due esperti hanno illustrato a ricercatori, rappresentanti del Servizio Fitosanitario regionale e studenti l’esperienza del Sudafrica relativamente alla gestione di Tristeza e Huanglongbing e, più in generale, alla strategia in atto per ottenere materiale di propagazione “pulito” da qualsiasi patogeno.

Rachelle Bester ha ricordato che HTS ha contribuito in modo determinante alla scoperta di numerosi virus e viroidi in molte colture, e che molti paesi stanno studiando come applicarla nei programmi fitosanitari di routine. Nel caso degli agrumi, in Sudafrica sono stati esaminati diversi protocolli a confronto con il saggio molecolare RT-PCR, risultando affidabile e comparabile. In entrambi i casi, la concentrazione del patogeno e il metodo di estrazione dal campione possono influenzare il risultato; ostacoli più facilmente superabili con HTS, aumentando la profondità di sequenziamento. Attraverso la metodologia Illumina hanno ottenuto un profilo accurato del viroma e la validazione del processo”.

Grazia Licciardello, ricercatrice presso il CREA di Acireale, che ha già messo a punto una procedura di analisi HTS applicata agli agrumi, funzionale alle attività di sorveglianza fitosanitaria e di controllo di prodotti a rischio, dal canto suo specifica come “nel progetto NovArancia, Agrobiotech e CREA stanno procedendo alla validazione del metodo anche per l’applicazione alla certificazione del materiale di propagazione di categoria “base”, il cui processo di accertamento fitosanitario richiede lunghi tempi di analisi (6-12 mesi)”.

“In NovArancia però, oltre al confronto HTS/RT-PCR – prosegue Liccardello – grande attenzione è posta al raffronto con i saggi biologici su piante indicatrici, in quanto ufficialmente riconosciuti a livello internazionale. L’obiettivo finale è quello di definire i possibili ambiti di adozione nel sistema normativo italiano e UE”.

Al seminario hanno fatto seguito visite in agrumeti, coordinate da Salvatore Leocata (ASA), e riunioni con i ricercatori Agrobiotech e CREA-Acireale che partecipano al progetto NovArancia, al termine delle quali sono stati esaminati percorsi di collaborazione in riferimento alla validazione e alla semplificazione della procedura.

Link all’articolo: https://www.freshplaza.it/article/9462771/innovazioni-tecnologiche-per-la-certificazione-genetica-e-fitosanitaria/

Presentazioni del convegno di giorno 18 luglio

Introduzione al Convegno di presentazione – Prof. Antonino Catara, Innovation Broker del Progetto

Obiettivi e linee pilota – Cinzia Oliveri, Responsabile del Progetto

Implementazione del processo di certificazione fitosanitaria delle piante madri – Giuseppe Scuderi, R&S AgroBiotech